Special Agent Leroy Jethro Gibbs ist der Anführer eines Teams von Spezialagenten des NCIS (Naval Criminal Investigative Service) Major Case Response Team. Gibbs, ein ehemaliger Marine, ist ein hartnäckiger Ermittler und ein hochqualifizierter Verhörspezialist, der sich ebenso auf sein Bauchgefühl wie auf Beweise verlässt.
Gibbs' rechte Hand ist Senior Field Agent Tony DiNozzo, ein Frauenheld und Filmzitat-Verwender, der früher als Mordermittler in Baltimore tätig war und trotz seiner Clown-Art immer den Job erledigt. Das Team besteht außerdem aus der probeweise eingestellten Field Agent Eleanor Bishop, einer ehemaligen NSA-Agentin, sowie dem Junior Field Agent Timothy McGee, einem computerversierten Agenten, der oft von DiNozzo verspottet wird.
Unterstützt werden sie von Abby Sciuto, der energiegeladenen, aber gothischen Labortechnikerin, die wie eine Tochter für Gibbs ist, und Dr. Donald Mallard, genannt Ducky, dem exzentrischen Rechtsmediziner voller ungewöhnlicher Geschichten. Dieses Team von Elite-Agenten mit Sitz in Washington, D.C., löst Kriminalfälle, die Marine- und Marineangehörige sowie deren Familien betreffen, manchmal reisen sie dafür durch die Vereinigten Staaten - oder die Welt.