Desmond Miles kehrt ins Italien der Renaissance zurück, um das Leben seines Vorfahren Ezio Auditore zu verfolgen. Nachdem er gesehen hat, wie sein Haus zerstört wurde, reist Ezio nach Rom, um den Assassinen-Orden wieder aufzubauen und die Familie Borgia zu stürzen, die die Stadt mit eiserner Faust regiert. Unterwegs hoffen die modernen Attentäter, den Standort des Stücks Eden oder "Der Apfel" zu entdecken, bevor die Templer es zuerst herausfinden.