Nach der Flucht aus Abstergo wird Desmond Miles von Lucy Stillman zu einem Unterschlupf für Attentäter geführt und greift auf die genetischen Erinnerungen von Ezio Auditore da Firenze zu, seinem Vorfahren aus dem Italien der Renaissance im 15. Jahrhundert. Nachdem Ezio miterlebt hat, wie sein Vater und seine Brüder ermordet wurden, wird er zum Attentäter und schwört Rache an denen, die das Verbrechen begangen haben. Mit der Hilfe von Familienangehörigen und realen historischen Persönlichkeiten, darunter Leonardo da Vinci, deckt Ezio eine größere Verschwörung auf, die ihn direkt zum religiösen Zentrum der Welt und zu einem Spanier namens Rodrigo Borgia führen sollte, dem Mann, der später Papst Alexander VI. werden sollte .