Desmond Miles, atası Ezio Auditore'nin hayatını takip etmek için Rönesans İtalya'sına geri döner. Evinin yıkıldığını gören Ezio, Assassin Order'ı yeniden inşa etmek ve şehri demir yumrukla yöneten Borgia ailesini devirmek için Roma'ya gider. Yol boyunca, modern zaman suikastçıları, Tapınakçılar ilk önce öğrenmeden önce Cennet Parçası'nın veya "Elma"nın yerini keşfetmeyi umuyorlar.