Desmond Miles retourne dans l'Italie de la Renaissance pour suivre la vie de son ancêtre Ezio Auditore. Après avoir vu sa maison détruite, Ezio se rend à Rome dans le but de reconstruire l'Ordre des Assassins et de faire tomber la famille Borgia, qui dirige la ville d'une main de fer. En cours de route, les assassins des temps modernes espèrent découvrir l'emplacement du morceau d'Éden, ou "La pomme" avant que les Templiers ne le découvrent en premier.