Après s'être échappé d'Abstergo, Desmond Miles est conduit dans un refuge pour assassins par Lucy Stillman et accède aux mémoires génétiques d'Ezio Auditore da Firenze, son ancêtre de l'Italie de la Renaissance du XVe siècle. Après avoir vu son père et ses frères assassinés, Ezio devient un assassin et jure de se venger de ceux qui ont commis le crime. Avec l'aide de sa famille et de véritables personnages historiques, dont Léonard de Vinci, Ezio découvre une plus grande conspiration qui le mènerait directement au centre religieux du monde et à un Espagnol du nom de Rodrigo Borgia, l'homme qui allait devenir le pape Alexandre VI. .